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細(xì)胞培養(yǎng)過(guò)程中血清使用常見(jiàn)問(wèn)題解答
  • 更新日期:2024-02-19      瀏覽次數(shù):280
    • 今天我們就來(lái)看看在細(xì)胞培養(yǎng)過(guò)程中血清使用方面常見(jiàn)的問(wèn)題,如:血清儲(chǔ)存條件、如何程序解凍、細(xì)胞污染與血清之間的關(guān)系、傳說(shuō)中的“黑膠蟲(chóng)"是什么以及血清熱滅活是否有必要等等,“工欲善其事,必先利其器",通過(guò)今天的解析與學(xué)習(xí)可以讓我們?cè)谧黾?xì)胞培養(yǎng)相關(guān)實(shí)驗(yàn)時(shí)事半功倍!

      Q1:血清長(zhǎng)期儲(chǔ)存的條件和方法是什么?
      A1:血清如需長(zhǎng)期保存,則必須儲(chǔ)存于-10℃或更低溫冰箱中,建議存放于-20℃的冰箱中。研究表明儲(chǔ)存在-80℃條件下的血清在性能方面變化不大,但由于解凍時(shí)溫差過(guò)大,會(huì)導(dǎo)致析出更多沉淀,使得背景雜亂,因此血清長(zhǎng)期保存不建議處于-80℃條件下。如果近期會(huì)頻繁使用血清,我們建議不要在4℃條件下存放超過(guò)1個(gè)月,若一次無(wú)法用完整瓶建議分裝后保存,且要避免反復(fù)凍融。另外,血清冰凍后體積會(huì)增加約10%,因此血清分裝時(shí)請(qǐng)留意預(yù)留一定的體積空間。

      Q2:如何進(jìn)行血清的程序性解凍?血清才不會(huì)使產(chǎn)品質(zhì)量受損?
      A2:程序性解凍血清可以確保血清制品質(zhì)量的穩(wěn)定性,且不會(huì)因?yàn)闇夭钸^(guò)大而析出過(guò)多蛋白等沉淀。程序性解凍方法是于實(shí)驗(yàn)開(kāi)始之前將冷凍的血清置于4℃冰箱中融解,并且在解凍過(guò)程中每隔1小時(shí)搖勻一次,使溫度與成分均一,減少沉淀析出,直至全部解凍,然后再移入室溫條件下使用。

      Q3:血清解凍后發(fā)現(xiàn)絮狀沉淀該如何處理?
      A3:造成血清發(fā)生絮狀沉淀的原因主要是血清解凍過(guò)程中溫差帶來(lái)了脂蛋白變性和纖維蛋白析出,沉淀本身不會(huì)影響血清質(zhì)量,也不會(huì)對(duì)實(shí)驗(yàn)結(jié)果造成影響。但如必須處理沉淀,則可通過(guò)離心方式去除,如500-1000×g離心5-10 min。

      Q4:血清沉淀是什么?
      A4:用于細(xì)胞培養(yǎng)的胎牛血清及其他血類制品中均存在各種類型的沉淀,如纖維蛋白和磷酸鈣等。一些絮狀沉淀主要就是纖維蛋白,通常我們?nèi)庋劭梢?jiàn),大小在1-2mm之間;而磷酸鈣在顯微鏡下觀察呈現(xiàn)布朗運(yùn)動(dòng)的小黑點(diǎn),通常被誤認(rèn)為是微生物污染。血清沉淀往往比較難以預(yù)測(cè)和控制,但幸運(yùn)的是這些沉淀不會(huì)影響血清品質(zhì)。

      Q5:血清中的小黑點(diǎn)是“黑膠蟲(chóng)"么?
      A5:血清解凍過(guò)程溫差過(guò)大、經(jīng)反復(fù)凍融或通過(guò)熱滅活處理后更容易產(chǎn)生沉淀,這些沉淀物在鏡下觀察時(shí)有一些會(huì)呈現(xiàn)以布朗運(yùn)動(dòng)的小黑點(diǎn),業(yè)內(nèi)流行一種“黑膠蟲(chóng)"污染的說(shuō)法,但“黑膠蟲(chóng)"一直以來(lái)都是極為神秘的存在,至今科學(xué)家們也沒(méi)有完整的實(shí)驗(yàn)結(jié)果可以證實(shí)它究竟是一種生物還是非生物,更有人認(rèn)為“黑膠蟲(chóng)"是血清的原蟲(chóng),或誤以為是細(xì)菌或真菌污染。但科學(xué)家通過(guò)進(jìn)一步的研究發(fā)現(xiàn)它們更可能是血清中的蛋白結(jié)晶。這種結(jié)晶可能為蛋白析出,如纖維蛋白原凝結(jié)成纖維蛋白;或是鹽析出,如磷酸鈣等;也有一些是膽固醇和脂肪酸。

      Q6:如何判斷血清污染?
      A6:
      1、首先檢查并判斷外包裝是否有破損,一般瓶身破損的血清發(fā)生污染的可能性極大;

      2、將血清接種到血酯板上,培養(yǎng)后看是否有菌落形成;

      3、可通過(guò)質(zhì)量檢測(cè)試劑盒檢測(cè)結(jié)果判定,如支原體檢測(cè)試劑盒等。血清污染主要包括細(xì)菌污染、真菌污染和支原體污染。在細(xì)胞培養(yǎng)時(shí)想要確定血清存在細(xì)菌污染,可嘗試使用5-10倍濃度青鏈霉素雙抗沖擊培養(yǎng)24-48h;真菌污染的細(xì)胞無(wú)法搶救,應(yīng)立即將細(xì)胞瓶進(jìn)行高壓滅菌處理,并消毒培養(yǎng)箱;支原體污染可考慮更換早期代次細(xì)胞,或使用商品化支原體去除試劑。

      Q7:細(xì)胞形態(tài)不正常、生長(zhǎng)狀態(tài)異?;蛟鲋乘俾示徛欠衽c血清有關(guān)?
      A7:細(xì)胞形態(tài)異常需要綜合關(guān)注細(xì)胞代次、傳代操作、培養(yǎng)基和血清等諸多因素。如傳代次數(shù)過(guò)多或傳代時(shí)間過(guò)晚都有可能影響細(xì)胞的生長(zhǎng)狀態(tài)。有些細(xì)胞對(duì)血清具有一定適應(yīng)性,更換新批次血清時(shí)可能出現(xiàn)所含因子水平的差異而導(dǎo)致的細(xì)胞生長(zhǎng)狀態(tài)受到影響的現(xiàn)象,可以通過(guò)血清梯度替換或者增加細(xì)胞適應(yīng)時(shí)間來(lái)解決此類問(wèn)題。與此同時(shí)也要關(guān)注基礎(chǔ)培養(yǎng)基和傳代操作等方面是否存在一定問(wèn)題。

      Q8:如何做血清的梯度替換?
      A8:當(dāng)細(xì)胞培養(yǎng)實(shí)驗(yàn)需更換血清品牌時(shí),做程序性梯度替換方案尤為重要,因?yàn)椴煌放频难逅煞钟兴町?,血清更換會(huì)使細(xì)胞發(fā)生不適,從而出現(xiàn)細(xì)胞增殖緩慢或細(xì)胞狀態(tài)不佳等情況。建議的梯度替換方法為:培養(yǎng)基配置過(guò)程中先用25%新血清與75%原血清進(jìn)行混合,培養(yǎng)傳代1-2次;而后用50%新血清與50%原血清混合培養(yǎng)傳代;再用75%新血清與25%原血清混合培養(yǎng)傳代;最后使用新血清培養(yǎng)傳代。

      Q9:培養(yǎng)基中添加血清和抗生素后可長(zhǎng)期保存嗎?
      A9:新鮮培養(yǎng)基中添加血清和抗生素后,建議在2周內(nèi)使用完。

      Q10:血清的熱滅活是必須的嗎?
      A10:實(shí)驗(yàn)表明,經(jīng)熱滅活處理的血清對(duì)細(xì)胞生長(zhǎng)可能僅有微小促進(jìn)或沒(méi)有任何作用,甚至通常因高溫處理而損失掉血清中部分營(yíng)養(yǎng)成分從而影響血清質(zhì)量,造成細(xì)胞生長(zhǎng)速率降低。熱滅活過(guò)程中因局部溫度過(guò)高、搖晃不均勻或滅活時(shí)間過(guò)長(zhǎng),都會(huì)造成血清品質(zhì)下降,且經(jīng)熱滅活后的血清會(huì)增加發(fā)生蛋白沉淀概率。因此,若非必須血清不需要做熱滅活,而少數(shù)對(duì)補(bǔ)體敏感的細(xì)胞實(shí)驗(yàn),如某些免疫學(xué)實(shí)驗(yàn)或腺病毒包裝等,可酌情對(duì)血清進(jìn)行熱滅活操作。

      Q11:血清熱滅活應(yīng)如何操作?
      A11:
      1、熱滅活前,必須先將解凍后的血清搖勻,并恢復(fù)至室溫;

      2、取部分搖勻血清置于50ml離心管中,并準(zhǔn)備同規(guī)格對(duì)照管一個(gè);

      3、對(duì)照管內(nèi)加入血清等體積水;

      4、對(duì)照管內(nèi)插入溫度計(jì)進(jìn)行溫度預(yù)試,當(dāng)溫度達(dá)到 56℃時(shí)將恢復(fù)至室溫的血清放入水浴鍋30min;

      5、滅活過(guò)程中需要每隔5min輕輕晃動(dòng)搖勻,以保證溫度均一。

      Q12:血清為什么存在批間差?
      A12:血清批間差是客觀存在的,因?yàn)檠逯破穪?lái)源于天然活體,供體牛只的生理狀況、健康狀況均不同,且受飼養(yǎng)環(huán)境的地形、風(fēng)貌、飲食、水源等影響,體內(nèi)各類蛋白、生長(zhǎng)因子和酶類的含量均有巨大差異,所以血清具有含量復(fù)雜且不固定的特性,批間差異在所難免,因此批間差異小的血清不僅可以保證血清質(zhì)量,確保細(xì)胞培養(yǎng)效果,還能減少由于批間差異帶來(lái)的使用前測(cè)試,且避免實(shí)驗(yàn)結(jié)果的不可重復(fù)性。

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