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細(xì)胞培養(yǎng)三大步驟,科研人必看!
  • 更新日期:2023-05-05      瀏覽次數(shù):425
    • 01、復(fù)蘇

      細(xì)胞復(fù)蘇的原則: 快速融化
      必須將凍存在-196℃液氮中的細(xì)胞快速融化至37℃,使細(xì)胞外凍存時(shí)的冰晶迅速融化,避免冰晶緩慢融化時(shí)進(jìn)入細(xì)胞形成再結(jié)晶,對(duì)細(xì)胞造成損害。

      實(shí)驗(yàn)前準(zhǔn)備
      將水浴鍋提前預(yù)熱至37℃。
      細(xì)胞實(shí)驗(yàn)室進(jìn)行常規(guī)消毒,用75%酒精擦拭紫外線(xiàn)照射40min的超凈工作臺(tái)臺(tái)面,保證無(wú)菌。
      在超凈工作臺(tái)中按次序擺放好消過(guò)毒的離心管、吸管、培養(yǎng)瓶等即將使用的耗材及試劑。

      取出凍存管
      根據(jù)細(xì)胞凍存記錄按標(biāo)簽找到所需細(xì)胞的對(duì)應(yīng)編號(hào)。
      從液氮罐中取出細(xì)胞盒,取出所需的細(xì)胞,同時(shí)核對(duì)管外的編號(hào)。

      迅速解凍
      迅速將凍存管投入到已經(jīng)預(yù)熱的水浴鍋中迅速解凍,并要不斷的搖動(dòng),使管中的液體迅速融化。
      約1-2min后凍存管內(nèi)液體完quan溶解,取出用酒精棉球擦拭凍存管的外壁,再拿入超凈臺(tái)內(nèi)。

      平衡離心
      用架盤(pán)天平平衡后,放入離心機(jī)中3000r/min離心3分鐘。

      制備細(xì)胞懸液
      吸棄上清液。
      向離心管內(nèi)加入適量完quan培養(yǎng)液,吹打制成細(xì)胞懸液。
      用培養(yǎng)液懸液混懸沉淀細(xì)胞,細(xì)胞計(jì)數(shù)調(diào)整細(xì)胞濃度,放入培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。

      細(xì)胞計(jì)數(shù)
      細(xì)胞濃度以5×10 5 /ml為宜。

      培養(yǎng)細(xì)胞
      將符合細(xì)胞計(jì)數(shù)要求的細(xì)胞懸液分裝入培養(yǎng)瓶?jī)?nèi),將培養(yǎng)瓶放入37℃,5%CO 2 的培養(yǎng)箱內(nèi)2-4h(或者24-48h)后換液繼續(xù)培養(yǎng)培養(yǎng),換液的時(shí)間根據(jù)細(xì)胞情況而定。

      記錄復(fù)蘇日期
      結(jié)果分析
      判斷細(xì)胞復(fù)蘇成功與否,需要看復(fù)蘇后細(xì)胞貼壁率及細(xì)胞存活率(細(xì)胞存活率將凍存管內(nèi)剩余的細(xì)胞,臺(tái)盼藍(lán)染色法檢測(cè)復(fù)蘇細(xì)胞的存活率。呈藍(lán)色的細(xì)胞為死細(xì)胞,活細(xì)胞不著色。用細(xì)胞計(jì)數(shù)板和計(jì)數(shù)器計(jì)數(shù)細(xì)胞,得出細(xì)胞存活率)。
      如果復(fù)蘇后95%以上的細(xì)胞貼壁,而且細(xì)胞的活性好,這就說(shuō)明細(xì)胞復(fù)蘇的過(guò)程沒(méi)有問(wèn)題。復(fù)蘇的細(xì)胞恢復(fù)到正常生長(zhǎng),達(dá)到正常的生長(zhǎng)特性(比如細(xì)胞群體倍增時(shí)間等)后要再凍存以補(bǔ)充細(xì)胞儲(chǔ)存數(shù)量。

      ×× 初學(xué)者易犯錯(cuò)誤 ××
      水浴鍋未提前預(yù)熱或者未預(yù)熱到37℃直接融化。
      水浴鍋內(nèi)凍存管太多,導(dǎo)致傳熱不佳,使融化時(shí)間延長(zhǎng)。
      離心前忘記平衡,導(dǎo)致離心機(jī)損壞和細(xì)胞丟失。
      一次復(fù)蘇細(xì)胞種類(lèi)過(guò)多,忘記更換吸頭和吸管,導(dǎo)致細(xì)胞交叉污染。

      02、傳代

      1.傳代密度過(guò)高
      一旦細(xì)胞養(yǎng)太久至融合度過(guò)高(>90%)才傳代,容易使細(xì)胞產(chǎn)生老化現(xiàn)象,甚至是堆疊,再消化細(xì)胞時(shí)不易吹打成單顆細(xì)胞,即便再重新鋪盤(pán)傳代,細(xì)胞也無(wú)法回到原本的特性了。(如:?jiǎn)螌蛹?xì)胞,沒(méi)長(zhǎng)滿(mǎn)就發(fā)生堆疊現(xiàn)象)。

      解決方案
      盡量避免融合度過(guò)高,鏡下觀察融合度約達(dá)到80%即可傳代分盤(pán)。
      細(xì)胞融合度:在細(xì)胞培養(yǎng)中指的是細(xì)胞在培養(yǎng)表面(培養(yǎng)皿/瓶)所占的比例。

      2.傳代密度過(guò)低
      哺乳動(dòng)物貼壁培養(yǎng)細(xì)胞,若細(xì)胞培養(yǎng)到 80-90%密度需要開(kāi)始傳代,在傳代接種細(xì)胞密度過(guò)低,細(xì)胞間距離太遠(yuǎn),就無(wú)法在細(xì)胞間產(chǎn)生黏附及通信作用,幫助信號(hào)傳導(dǎo)并活化細(xì)胞;總體細(xì)胞量不足,分泌的生長(zhǎng)因子濃度會(huì)不足以產(chǎn)生利于生長(zhǎng)的微環(huán)境,以上皆會(huì)造成增殖速度遲緩或細(xì)胞死亡。

      解決方案
      細(xì)胞傳代時(shí),要進(jìn)行準(zhǔn)確的細(xì)胞計(jì)數(shù),確保鋪盤(pán)的密度。

      如何確定細(xì)胞的正確初始接種密度?

      美國(guó)細(xì)胞庫(kù)(ATCC)建議各類(lèi)不同細(xì)胞株接種密度:
      細(xì)胞類(lèi)型 接種密度
      常見(jiàn)腫瘤細(xì)胞株 2-4 x 10 6 viable cells/25cm 2
      成纖維細(xì)胞株 2-4 x 106 viable cells/25 cm2
      淋巴細(xì)胞/懸浮細(xì)胞 3-4 x 10 5 viable cells/ml
      雜交瘤 2 x 105 viable cells/ml
      成肌細(xì)胞 1-2 x 10 4 viable cells/ cm2 

      03、凍 存

      細(xì)胞凍存的基本原理: 慢凍
      手動(dòng)降溫:將細(xì)胞依序放在4℃(30分鐘)、-20℃(1小時(shí))、-80℃(過(guò)夜)后移至液氮中保存。
      程序降溫盒:是一般廣泛使用的降溫法,為一種特制冷凍容器(填充異丙醇或依靠特制金屬導(dǎo)熱),使細(xì)胞以每分鐘約-1℃的速度降至-80℃(過(guò)夜),然后移至液氮中保存。

      大家可以根據(jù)自身情況或者實(shí)驗(yàn)條件選擇不同的凍存方式。

      細(xì)胞凍存是細(xì)胞保存的主要方法之一。利用凍存技術(shù)將細(xì)胞置于-196℃液氮中低溫保存,可以使細(xì)胞暫時(shí)脫離生長(zhǎng)狀態(tài)而將其細(xì)胞特性保存起來(lái),這樣在需要的時(shí)候再?gòu)?fù)蘇細(xì)胞用于實(shí)驗(yàn)。而且適度地保存一定量的細(xì)胞,可以防止因正在培養(yǎng)的細(xì)胞被污染或其他意外事件而使細(xì)胞丟種,起到了細(xì)胞保種的作用。

      細(xì)胞代謝過(guò)程需要各種蛋白酶的參與,而這些蛋白酶在環(huán)境溫度低于-70℃時(shí)會(huì)集體罷工,低溫貯藏的目的是通過(guò)超低溫使代謝活動(dòng)近乎停止。細(xì)胞因此進(jìn)入休眠狀態(tài),使細(xì)胞“不會(huì)老",可以長(zhǎng)期保存。

      因?yàn)閮鋈谶^(guò)程對(duì)所有細(xì)胞和組織都是有一定傷害的,因此,需要開(kāi)發(fā)出有效的技術(shù)來(lái)防止細(xì)胞死亡和損傷。

      這時(shí),低溫保護(hù)劑就發(fā)揮出它的作用了。

      低溫保護(hù)劑可保護(hù)細(xì)胞不受細(xì)胞內(nèi)冰凍影響,目前多采用DMSO、甘油、乙二醇和丙二醇等滲透型低溫保護(hù)劑。它們的作用機(jī)制包括:自由進(jìn)入細(xì)胞,取代水,使冰點(diǎn)下降,充當(dāng)鹽的二次溶劑,提高細(xì)胞膜對(duì)水的通透性。

      但是,部分低溫保護(hù)劑在緩慢冷凍過(guò)程中雖然會(huì)保護(hù)細(xì)胞,但它們也會(huì)引起細(xì)胞毒性,尤其是在室溫下。因此,在標(biāo)準(zhǔn)的自制凍存液中,會(huì)含有血清,血清是用來(lái)降低細(xì)胞毒性的,但血清也不是完mei的。

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