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細胞周期檢測(PI 法)
  • 更新日期:2023-04-06      瀏覽次數(shù):1529
    • 一、實驗目的
      通過檢測細胞內(nèi) 
      DNA 含量的變化,檢測外界干預手段對細胞生長周期的影響。

      二、實驗原理
      細胞周期(cell cycle):是指細胞從前一次分裂結(jié)束起到下一次分裂結(jié)束為止的活動過程,通常由 G0/G1 期、S 期、G2/M 期組成。G0/G1 期:二倍體細胞的 DNA 含量 (2N)。S 期:DNA 開始合成,這時細胞核內(nèi) DNA 的含量介于 G1 期和 G2 期之間。G2/M 期:DNA 復制結(jié)束成為 4 倍體(4N)。

      碘化丙啶 (Propidium, PI)PI 為插入性核酸熒光染料,能選擇性的嵌入核酸 DNA 或 RNA 雙鏈螺旋的堿基之間,產(chǎn)生紅色熒光,并且熒光強度和所嵌入的核酸含量成正比。細胞周期檢測時,首先用 RNA 酶將 RNA 消化排除影響,通過流式細胞術(shù)檢測 PI 熒光強度直接反映細胞各時相的 DNA 分布狀態(tài),從而計算出各時相的百分率。

      三、實驗步驟
      1. 細胞樣品的準備:待各實驗組細胞融合度達到 70%,用胰酶消化細胞,至細胞可以被輕輕用移液管或槍頭吹打下來時,加入含有
      血清的完quan培養(yǎng)基終止消化,吹打下所有的貼壁細胞,并輕輕吹散細胞。再次收集到離心管內(nèi)。1000 g 左右離心 3 分鐘,沉淀細胞。小心吸除上清。加入 1 毫升冰浴預冷的 PBS,重懸細胞,并轉(zhuǎn)移到 1.5 毫升離心管內(nèi)。再次離心沉淀細胞,小心吸除上清。輕輕彈擊離心管底以適當分散細胞,避免細胞成團。
      對于懸浮細胞:收集細胞到離心管內(nèi),1000 g 左右離心 3 分鐘,沉淀細胞。小心吸除上清,加入 1 毫升冰浴預冷的 PBS,重懸細胞,并轉(zhuǎn)移到 1.5 毫升離心管內(nèi)。再次離心沉淀細胞,小心吸除上清,輕輕彈擊離心管底以適當分散細胞,避免細胞成團。
      2. 細胞固定:加入 1 毫升冰浴預冷 70% 乙醇,輕輕吹打混勻,4℃ 固定過夜。1000 g 左右離心 3 分鐘,沉淀細胞。小心吸除上清,加入 1 毫升冰浴預冷的 PBS,重懸細胞。再次離心沉淀細胞,小心吸除上清,輕輕彈擊離心管底以適當分散細胞,避免細胞成團。
      3. 碘化丙啶染色液的配制:參考下表,根據(jù)待檢測樣品的數(shù)量配制適量的碘化丙啶染色液,現(xiàn)配現(xiàn)用:



      1個樣品6個樣品12個樣品
      RNase A (50X)10ul60ul120ul
      碘化丙啶染色液(25X)20ul120ul240ul
      染色緩沖液470ul2.82ml5.64ml
      Final volume500ul3.0ml6ml








      染色:每管細胞樣品中加入 0.5 毫升碘化丙啶染色液,緩慢并充分重懸細胞沉淀, 37℃ 避光溫浴 30 分鐘。

      流式檢測和分析:用流式細胞儀在激發(fā)波長 488nm 波長處檢測紅色熒光,同時檢測光散射情況。采用分析軟件進行細胞 DNA 含量分析和光散射分析。


      常見問題及解答

      Q1:是否可以直接用乙醇固定細胞?

      A:不可以,直接 70~75% 乙醇加入很容易導致細胞聚團現(xiàn)象,很難重懸成單細胞,影響固定效果,其至容易導致固定后無細胞沉淀的現(xiàn)象。正確做法是: 待細胞, 充分分散成單細胞后,緩慢地滴入無水乙醇中,使其終濃度為 70~75%7 醇。


      Q2:細胞量過少,無法獲得數(shù)據(jù)結(jié)果?

      A:首先,要保證收集足夠的細胞樣品 (個人經(jīng)驗至少收集 100 萬左右): 如果藥物處理后。細胞死亡過多,應該降低藥物濃度;其次,固定細胞時先用預冷的 PBS 重懸細胞,再逐滴滴入無水乙醇中;細胞清洗時,不可過度吹打細胞,以防產(chǎn)生過多的細胞碎片。最后,盡量采用尖底的離心管和水平的離心機,離心后盡量用移液槍吸走上清,不要傾倒,殘留一點,不要吸完。


      Q3:什么樣的數(shù)據(jù)結(jié)果可以用?
      A:G2/M 期細胞的 DNA 含量是 G1 期的 2 倍,在直方圖上形成一個 2 倍于 G1 信號峰的高斯峰;CV(變異系數(shù)) 表示峰的寬度,CV 值越小,峰形越好,最好是在 5% 左右,一般小于 10%
      也被認可。RCS 最好是在 1~3,高于 5 則不被認可。RCS 高,說明數(shù)據(jù)的分布和軟件所建立模型的預期值的差別比較大,可能由于處理細胞的時候 RNA 酶消化不好,或者是 PI 的濃度不佳造成的。

      Q4:如何提高分辨率和精確度?
      A:變異系數(shù) (Coefficient of Variation,CV 值) 反映 G0/G1 峰分辨率和精確度。而樣品 CV 值為樣品固有,與樣本制備過程中細胞質(zhì)量有關(guān)。細胞碎片越少、細胞聚團越少、RNA 酶消化越充分,可以減少樣本的 CV 值,提高 G0/G1 峰分辨率和精確度。

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